3 maneiras de fazer o método de coloração de Gram

2024 Autor: Jason Gerald | [email protected]. Última modificação: 2023-12-16 11:33

A coloração de Gram é uma técnica rápida e é usada para ver a presença de bactérias em uma amostra de tecido e para classificar as bactérias como Gram-positivas ou Gram-negativas, com base nas propriedades químicas e físicas de suas paredes celulares. A coloração de Gram é quase sempre usada como a primeira etapa no diagnóstico de uma infecção bacteriana.

Esta técnica de coloração tem o nome do cientista dinamarquês Hans Christian Gram (1853 - 1938), que desenvolveu a técnica em 1882 e a publicou em 1884 como uma técnica para distinguir entre dois tipos de bactérias com sintomas clínicos semelhantes: Streptococcus pneumoniae (também conhecido como Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) e a bactéria Klebsiella pneumoniae.

Etapa

Método 1 de 3: preparando a lâmina de microscópio

Etapa 1. Prepare-se para trabalhar no laboratório

Use luvas e uma presilha de cabelo comprido para evitar a contaminação bacteriana da amostra que você está testando. Limpe a área de trabalho sob uma coifa ou em outra área bem ventilada. Verifique o queimador de Bunsen e certifique-se de que o microscópio está funcionando corretamente antes de começar.

Etapa 2. Esterilize a lâmina de vidro do microscópio

Se a lâmina de vidro estiver suja, lave-a com água e sabão para remover óleo e sujeira. Limpe as lâminas com etanol, limpador de vidros ou outro método usado por seu laboratório.

Etapa 3. Coloque a amostra na lâmina de vidro

Você pode usar a técnica de coloração de Gram para ajudar a identificar bactérias em uma amostra médica ou em uma cultura de bactérias crescendo em uma placa de Petri. Para obter melhores resultados, use a coloração de Gram em pinceladas finas da amostra. É aconselhável usar amostras com menos de 24 horas, pois bactérias mais velhas podem ter danificado suas paredes celulares e podem não responder à coloração de Gram.

Se estiver usando uma amostra de tecido, adicione 1-2 gotas a uma lâmina de vidro. Espalhe uniformemente na lâmina para formar uma camada fina de amostra, espalhando, deslizando-a usando a borda da outra lâmina de vidro estéril. Deixe secar antes de dar o próximo passo.
Se você estiver retirando bactérias de uma placa de Petri, esterilize o ciclo de inoculação em um bico de Bunsen até que brilhe e, em seguida, deixe esfriar. Use a alça para pingar água esterilizada na lâmina, depois esterilize e esfrie novamente antes de usá-la para coletar uma pequena amostra de bactérias. Depois disso mexa delicadamente.
A bactéria preparada no caldo deve ser agitada novamente em vórtice e, em seguida, retirada com a alça de inoculação acima, sem adição de água.
Se você tiver uma amostra de cotonete (geralmente feito com uma pequena alça com ponta de algodão), toque e gire suavemente o cotonete sobre a lâmina.

Etapa 4. Uma temperatura ligeiramente alta pode fazer um bom esfregaço

O calor manterá as bactérias no topo da lâmina, para que elas não se dissolvam facilmente durante o processo de coloração. Bata rapidamente na lâmina duas a três vezes em um bico de Bunsen ou aqueça a lâmina em um aquecedor elétrico de lâminas. Não superaqueça, a amostra pode ser danificada. Se você estiver usando um bico de Bunsen, deve ser uma chama pequena, mas azul, em vez de uma grande chama laranja.

Alternativamente, um esfregaço também pode ser feito com metanol, adicionando 1-2 gotas de metanol a um esfregaço seco, secando o metanol remanescente na lâmina deixando-a ao ar livre. Esta técnica minimiza os danos às células e fornece um fundo de imagem de slide limpo

Etapa 5. Posicione o slide sobre a bandeja de coloração

As bandejas de coloração são feitas de metal, vidro ou placas de plástico rasas com uma malha macia no topo. Coloque as lâminas sobre essas redes, para que o líquido que você usa possa ser drenado para a bandeja.

Se você não tiver uma bandeja para colorir, pode colocar uma lâmina em uma bandeja de plástico para imprimir cubos de gelo

Método 2 de 3: Processo de coloração de Gram

Etapa 1. Despeje o líquido cristal violeta sobre o esfregaço

Use uma pipeta para borrifar uma amostra de bactéria com algumas gotas de corante violeta de cristal, também conhecido como violeta de genciana. Deixe por 30-60 segundos. O violeta de cristal (KV) se separa em solução aquosa em íons KV + e cloreto (Cl-). Esses íons penetram nas paredes celulares e nas membranas celulares de bactérias gram-positivas e gram-negativas. O íon KV + interage com os componentes carregados negativamente das células bacterianas, dando às células uma cor roxa.

Muitos laboratórios usam violeta de cristal "Hucker", que contém oxalato de amônio para evitar a precipitação

Etapa 2. Enxágüe o violeta de cristal delicadamente

Incline a lâmina e use um frasco lavador para borrifar um pequeno jato de água destilada ou da torneira sobre a lâmina. A água deve escorrer sobre a superfície do esfregaço e não deve ser borrifada diretamente sobre o esfregaço. Não enxágue excessivamente. Pode remover manchas em bactérias Gram positivas.

Etapa 3. Lave o esfregaço com iodo e depois enxágue

Use um conta-gotas para limpar o esfregaço com iodo. Deixe-o ligado por pelo menos 60 segundos e, em seguida, enxágue cuidadosamente da mesma maneira que acima. O iodo, na forma de um íon carregado negativamente, interage com KV + para formar um grande complexo composto entre o violeta de cristal e o iodo (complexo composto CV-I) nas camadas interna e externa da célula. Este complexo de compostos reterá a cor violeta do cristal violeta dentro da célula, nos locais manchados.

O iodo é uma substância corrosiva. Evite inalação, ingestão ou contato com a pele

Etapa 4. Adicione alvejante colorido e enxágue rapidamente

Uma mistura 1: 1 de acetona e etanol é normalmente usada para esta etapa importante, que deve ser cuidadosamente cronometrada. Posicione a lâmina em um determinado ângulo e, em seguida, adicione alvejante colorido até que não haja mais púrpura visível na água usada para o enxágue. Isso geralmente leva menos de 10 segundos, ou ainda menos tempo se o alvejante contiver uma alta concentração de acetona. Pare esta etapa imediatamente, caso contrário, o corante também lixiviará o violeta de cristal das células gram-positivas e negativas, e o processo de coloração deve ser repetido. Enxágue imediatamente o excesso de alvejante de cor usando a técnica anterior.

A acetona pura (95% +) pode ser usada como substituto. Quanto mais acetona você usar, mais rápido o alvejante funcionará, então você precisa prestar mais atenção ao tempo.
Se você estiver tendo problemas para controlar o tempo desta etapa, adicione descolorante gota a gota.

Etapa 5. Polvilhe o contra-corante sobre o esfregaço e enxágue

Uma contra-coloração, geralmente safranina ou fucsina, é usada para aumentar o contraste entre as bactérias gram-negativas e gram-positivas, por meio da coloração de bactérias descoloridas (descoloridas), ou seja, bactérias gram-negativas, rosa ou vermelha. Deixe por pelo menos 45 segundos, em seguida, enxágue.

A fucsina tingirá intensamente muitas bactérias gram-negativas, como Haemophilus spp e Legionella spp. Este método é bom para iniciantes

Etapa 6. Seque a lâmina

Você pode secá-los ao ar livre para secar ou secar com papel absorvente vendido para esse fim. O processo de coloração de Gram está completo.

Método 3 de 3: Verificando os resultados da coloração

Etapa 1. Prepare o microscópio óptico

Coloque a lâmina sob o microscópio. As bactérias variam muito em tamanho, então a ampliação total necessária variará de 400x a 1000x. Uma lente objetiva com óleo de imersão é recomendada para uma imagem mais nítida. Deixe cair o óleo de imersão na lâmina, evitando movimento enquanto goteja para evitar a formação de bolhas. Mova a alça da lente do microscópio para que a lente da objetiva se encaixe no lugar e toque o óleo.

A imersão em óleo só pode ser usada em lentes especialmente projetadas, não em lentes "secas"

Etapa 2. Tente identificar bactérias gram positivas e gram negativas

Examine a lâmina em um microscópio de luz. As bactérias Gram-positivas aparecem na cor roxa, porque o cristal violeta fica preso dentro da espessa parede celular. As bactérias Gram-negativas terão cor rosa ou vermelha, porque o cristal violeta é enxaguado através das paredes celulares finas, onde o contra-corante rosa entra.

Se a amostra for muito espessa, o resultado pode ser um falso positivo. Mancha uma nova amostra se mostrar todas as bactérias gram-positivas, para se certificar de que o resultado está correto.
Se você usar muito alvejante colorido, o resultado pode ser um falso negativo. Mancha uma nova amostra se mostrar todas as bactérias gram negativas, para se certificar de que o resultado está correto.

Etapa 3. Compare os resultados que você vê com a imagem de referência

Se você não sabe a aparência das bactérias, estude a coleção de imagens de referência, geralmente classificadas por formato e coloração de Gram. Você também pode visualizar bancos de dados online em [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos e muitos outros sites online. Para facilitar a identificação, abaixo estão exemplos de bactérias que são comumente encontradas ou importantes para o diagnóstico, classificadas de acordo com seu estado de Gram e forma.

Etapa 4. Identificar bactérias gram-positivas com base em sua forma

As bactérias são ainda classificadas de acordo com sua forma sob o microscópio, mais comumente como cocos (esféricos) ou bastonetes (cilíndricos). Aqui estão alguns exemplos de bactérias gram-positivas (de cor roxa) de acordo com sua forma:

Cocos gram positivos geralmente estafilococos (significando cocos de grupo) ou estreptococos (significando cocos de cadeia).
'Bastonetes Gram-positivos, como Bacillus, Clostridium, Corynebacterium e Listeria. A bactéria dos bastonetes Actinomyces spp. geralmente têm ramos ou filamentos.

Etapa 5. Identificar bactérias gram negativas

As bactérias Gram-negativas (de cor rosa) são frequentemente classificadas em três grupos. Os cocos são de forma esférica, as hastes são longas e finas, enquanto as hastes cocóides estão no meio.

Cocos Gram negativos O mais comum é Neisseria spp.
Bastonetes gram-negativos por exemplo, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas e muitos outros. O Vibrio cholerae pode ser visto como uma haste regular ou curva.
Bactérias de bastonetes Gram-negativas "cocóides" (ou "cocobacilos") por exemplo, Bordetella, Brucella, Haemophilus e Pasteurella

Etapa 6. Verifique cuidadosamente se os resultados são mistos

Algumas bactérias são difíceis de colorir com precisão, devido à fragilidade ou natureza cerosa de suas paredes celulares. Essas bactérias podem apresentar uma mistura de roxo ou rosa na mesma célula ou entre células diferentes no mesmo esfregaço. Amostras bacterianas com mais de 24 horas podem mostrar esse problema, mas também existem algumas espécies bacterianas que permanecem difíceis de colorir em qualquer idade de amostragem. Essas bactérias requerem testes mais especializados para identificação, como coloração ácido-resistente, observação em cultura bacteriana, meio de cultura TSI ou teste genético.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium e Propionibacterium spp. todas são bactérias gram-positivas, mas muitas vezes não são claramente coradas.
Bactérias pequenas e delgadas, como Treponema, Chlamydia e Rickettsia spp. difícil de manchar pelo método de Gram.

Etapa 7. Descarte todos os consumíveis e equipamentos restantes

Este procedimento de eliminação de resíduos varia entre laboratórios e depende dos materiais usados. Normalmente, o líquido na bandeja de coloração é descartado em frascos rotulados como resíduos perigosos. Mergulhe as lâminas em solução de alvejante a 10% e descarte em um recipiente para objetos cortantes.

Pontas

Lembre-se de que os resultados da coloração de Gram só serão bons se a amostra for boa. É importante informar os pacientes para que possam fornecer uma boa amostra (por exemplo, a diferença entre cuspir e tosse profunda para obter uma amostra de escarro).
Como um alvejante colorido, o etanol reage mais lentamente do que a acetona.
Cumpra os regulamentos laboratoriais padrão para garantir a segurança.
Use um cotonete de bochecha para praticar, porque contém bactérias gram-positivas e gram-negativas. Se você observar apenas um tipo de bactéria, pode estar usando pouco ou muito alvejante.
Você pode usar fechos de madeira para proteger o slide.

Aviso

A acetona e o etanol são substâncias inflamáveis. A acetona remove o óleo das mãos, facilitando a absorção de outros produtos químicos pela pele. Use luvas e use-as com cuidado.
Não deixe o esfregaço secar antes de enxaguar a coloração de Gram ou a contracoloração.